在全球范圍內(nèi)，冠心?。╟oronary artery disease，CAD）具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康。最近的研究表明，CAD的發(fā)病機(jī)制與環(huán)境危險(xiǎn)因素、遺傳因素和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。目前我們對(duì)CAD中的免疫介導(dǎo)過(guò)程還處于探索階段。單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）作為新一代測(cè)序技術(shù)，可以在單個(gè)細(xì)胞水平上探索免疫系統(tǒng)，能夠檢測(cè)稀有細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄組水平，探索來(lái)自細(xì)胞群體中單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)趨勢(shì)，對(duì)于識(shí)別CAD的新型診斷治療靶標(biāo)具有重要意義。

2023年9月18日，江蘇省人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）賈恩志教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合鹽城市中醫(yī)院團(tuán)隊(duì)在BBA-Molecular Cell Research在線發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing atlas of peripheral blood mononuclear cells from subjects with coronary artery disease”的研究論文，揭示了JUN信號(hào)通路可能是冠心病的重要的潛在診斷和治療分子靶點(diǎn)。

方案剖析

樣本設(shè)計(jì)：測(cè)序組：3例CAD患者(病例)和3例非CAD患者(對(duì)照組)的PBMC樣本；驗(yàn)證組：75名CAD患者和44名對(duì)照組。

檢測(cè)技術(shù)：10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；qRT-PCR。

主要結(jié)論分享

1? 冠心病患者和非冠心病患者的循環(huán)免疫細(xì)胞譜

經(jīng)過(guò)濾后，共計(jì)有67,447個(gè)細(xì)胞參與后續(xù)數(shù)據(jù)分析，聚類后共計(jì)獲得33個(gè)cluster(后續(xù)簡(jiǎn)寫(xiě)成C)和5種細(xì)胞類型，即單核細(xì)胞（C0, 11, 13, 24, and 30)、NK細(xì)胞(C1,2,12,27, and 32)、T細(xì)胞(C3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 28 and 31)、B細(xì)胞(cluster 9, 17, 21, and 29)和血小板(C23 and 26))，其中，C1 (NK)、C3 (CD8 + Naive T)、C4 (CD8 + Naive T)、C2 (NK)和C0 (CD16-單核細(xì)胞)是CAD病例中最占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞集群。而在對(duì)照組中，C1(NK細(xì)胞)、C5(T細(xì)胞)、C0(CD16-單核細(xì)胞)、C2(NK細(xì)胞)、C9(B細(xì)胞)是細(xì)胞數(shù)量最多的前5個(gè)細(xì)胞簇。盡管兩組之間33個(gè)cluster的豐度沒(méi)有顯著差異(p <0.05)，病例組中CD16-單核細(xì)胞C30的豐度高于對(duì)照組(28.00±7.94 vs. 15.33±4.93,p = 0.079)。

圖1 冠心病患者和非冠心病患者細(xì)胞t-SNE/UMAP聚類結(jié)果

2? CAD病例與對(duì)照組單核細(xì)胞基因水平分析

為了確定CAD患者的免疫特性，下游分析主要集中在單核細(xì)胞上。作者通過(guò)分析了CAD與對(duì)照組各聚類之間的差異表達(dá)基因，以確定在疾病狀態(tài)下發(fā)生變化的關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步探討其在CAD發(fā)生發(fā)展中的具體作用。作者發(fā)現(xiàn)三個(gè)差異表達(dá)基因(JUN, HLA-DRB5和RPS4Y1)在C0，C11，C13和C24中均有表達(dá)。FOSB在C0、C11、C13和C30中均有表達(dá)。

圖2 兩組間單核細(xì)胞各簇差異表達(dá)基因(DEGs)的火山圖

3? 單核細(xì)胞中標(biāo)記基因和差異表達(dá)基因的

GO和KEGG富集分析

作者通過(guò)進(jìn)行GO和KEGG富集分析以闡明DEGs在單核細(xì)胞中的功能意義。結(jié)果表明，C0中的DEGs顯著富集在翻譯起始、胞質(zhì)核糖體和核糖體結(jié)構(gòu)成分中。C11中的DEGs富集中性粒細(xì)胞脫粒、MHC蛋白復(fù)合物和肽結(jié)合。C13中的DEGs在病毒轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞質(zhì)核糖體和核糖體結(jié)構(gòu)成分中富集。C24中的DEGs在抗原加工和遞呈、MHC蛋白復(fù)合物和肽抗原結(jié)合中富集。C30的DEGs富集在膠原的細(xì)胞外基質(zhì)和RAGE受體結(jié)合中。KEGG通路分析中顯示不同的聚類揭示了SARS-Cov-2與心血管疾病之間的密切相關(guān)性。在DEGs富集分析中，冠狀病毒病- covid -19 KEGG通路在C0(單核細(xì)胞CD16-)、C11(單核細(xì)胞CD16+)和C13(單核細(xì)胞)中富集。但是上述分析仍需要在未來(lái)的研究中進(jìn)行討論和驗(yàn)證。

圖3 CAD病例和對(duì)照組間單核細(xì)胞的差異表達(dá)基因(DEGs) GO分析

4? CAD病例與對(duì)照組單核細(xì)胞的細(xì)胞軌跡特征

作者通過(guò)細(xì)胞軌跡分析以推斷單核細(xì)胞亞群的分化狀態(tài)，重建細(xì)胞的進(jìn)化過(guò)程，并確定差異表達(dá)基因的軌跡。圖4A顯示了二維狀態(tài)空間中五個(gè)單核細(xì)胞亞群的擬時(shí)間軌跡。軌跡方向如圖4B所示。分析結(jié)果表明，C13(單核細(xì)胞)主要處于發(fā)育軌跡的開(kāi)始階段，C0(CD16-單核細(xì)胞)和C30(CD16-單核細(xì)胞)主要處于擬時(shí)間軌跡的結(jié)束階段。與對(duì)照組相比，CAD組在擬時(shí)間軌跡末端有更多的C30簇，表明C30(單核細(xì)胞CD16-)在CAD過(guò)程中發(fā)揮了重要作用(圖4C)。同時(shí)，進(jìn)一步分析了DEG基因沿?cái)M時(shí)間軌跡的變化。擬時(shí)間分析中鑒定出的前10個(gè)基因(ACAP3、AL627309.5、HES4、ISG15、LINC00115、LINC01128、NOC2L、PUSL1、TNFRSF18和TNFRSF4)在不同單核細(xì)胞簇中的表達(dá)趨勢(shì)如圖4D所示。沿軌跡，TNFRSF18和TNFRSF4的表達(dá)逐漸降低。接下來(lái)，作者將基因分成三個(gè)“簇”，將基因按照相似的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)沿著軌跡進(jìn)行分類，同時(shí)分析了基因沿著細(xì)胞軌跡的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)LINC001128、TNFRSF18和TNFRSF4的表達(dá)逐漸減少；而ACAP3的表達(dá)呈進(jìn)行性升高(圖4E)。作者鑒定了branch1和branch2在擬時(shí)間發(fā)育軌跡上存在顯著差異的基因，以探索確定細(xì)胞命運(yùn)分支的基因模式(圖4F-G)。結(jié)果表明，ACAP3可能是細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵決定因素。

圖4 不同單核細(xì)胞亞型的發(fā)育軌跡與擬時(shí)間分析

5? CellPhoneDB基于單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)中

潛在的受體-配體相互作用評(píng)估細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)

CellPhoneDB被用于探索單核細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞在PBMC中的細(xì)胞間通訊。利用熱圖函數(shù)分析免疫細(xì)胞之間的相互作用。結(jié)果表明，多種單核細(xì)胞明顯活躍，并與T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和血小板交流(圖7A)。此外，分析顯示CAD和對(duì)照之間的細(xì)胞通信總體上相似。但與對(duì)照組相比，CAD組的交流次數(shù)有所減少。這些差異揭示了CAD中細(xì)胞間通過(guò)信號(hào)通路進(jìn)行功能合作的改變。通過(guò)單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類SCENIC分析，進(jìn)一步鑒定單核細(xì)胞亞簇中潛在調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子活性與基因表達(dá)活性的差異。由此確定了一系列tf及其可能的靶基因，以研究其核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并為探索其潛在的疾病機(jī)制提供基礎(chǔ)。有趣的是，F(xiàn)OS、FOSB和JUN的調(diào)控活性(AUC)評(píng)分在單核細(xì)胞亞群中更高，這進(jìn)一步證實(shí)了之前的分析。值得注意的是，JUNB、FOS和JUN的表達(dá)在C0(單核細(xì)胞CD16-)、C11(單核細(xì)胞CD16+)、C13(單核細(xì)胞)和C24(單核細(xì)胞CD16-)中是共享的(圖8)。這些結(jié)果表明JUN信號(hào)通路可能是單核細(xì)胞集群中最活躍的調(diào)控途徑之一。

圖5 利用CellPhoneDB分析pbmc細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)

6? JUN作為CAD潛在生物標(biāo)志物的評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步評(píng)估JUN的診斷價(jià)值，共招募119名受試者進(jìn)行驗(yàn)證，其中75名CAD患者和44名對(duì)照組。驗(yàn)證樣本中JUN的一般特征及表達(dá)水平。結(jié)果表明，年齡(p<0.001)、高血壓(p=0.001)、空腹血糖(p = 0.004)和Gensini評(píng)分(p <0.001)在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CAD組JUN表達(dá)水平顯著升高。為了進(jìn)一步評(píng)估JUN是否與CAD的危險(xiǎn)因素相關(guān)，作者進(jìn)行了Spearman秩相關(guān)分析。結(jié)果顯示，JUN表達(dá)與血糖、血脂等臨床指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)性，但與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)(r = 0.342, p =0.001)。此外，也進(jìn)行單因素和多因素logistic回歸分析，以確定JUN作為CAD發(fā)生預(yù)測(cè)因子的潛在價(jià)值。隨著JUN表達(dá)水平的升高，CAD的發(fā)病率增加(OR: 1.528;95% ci: 1.086-2.149;P = 0.015)。在調(diào)整了年齡、高血壓和空腹血糖等因素后，隨著JUN表達(dá)的升高，冠心病的發(fā)病率增加(OR: 1.559;95% ci: 1.059-2.295;p = 0.024)。受試者ROC曲線顯示JUN表達(dá)升高的受試者患CAD的風(fēng)險(xiǎn)增加。

總結(jié)

本研究提供了來(lái)自冠心病患者和對(duì)照受試者的pbmc的單細(xì)胞RNA測(cè)序的詳細(xì)分析。這些數(shù)據(jù)提供了一系列證據(jù)，表明JUN信號(hào)通路可能是CAD的潛在診斷和治療分子靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Song X, Fu Y, Li C, Jia Q, Ren M, Zhang X, Bie H, Zhou H, Gan X, He S, Wang Y, Zhang S, Pan R, Sun W, Zhou H, Ni Q, Song J, Zhang Q, Chen X, Jia E. Single-cell RNA sequencing atlas of peripheral blood mononuclear cells from subjects with coronary artery disease. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2024 Jan;1871(1):119593. doi: 10.1016/j.bbamcr.2023.119593. Epub 2023 Sep 18. PMID:37730128.

相關(guān)研究結(jié)果或能擴(kuò)展醫(yī)生和科學(xué)家們對(duì)心血管疾病進(jìn)行診斷和治療的方法，將對(duì)心血管疾病的預(yù)防和診治產(chǎn)生重要的影響，為廣大心血管疾病患者帶來(lái)新的希望，為祖國(guó)的衛(wèi)生健康事業(yè)做出新的貢獻(xiàn)。

賈恩志教授工作室在鹽城市中醫(yī)院掛牌，南京-鹽城兩地全方位合作，不斷豐富臨床病種，帶動(dòng)基層醫(yī)院開(kāi)展臨床和基礎(chǔ)科學(xué)研究工作，加強(qiáng)了科研實(shí)力，讓更多患者能夠享受到更優(yōu)質(zhì)的醫(yī)療資源、更先進(jìn)的醫(yī)療成果。

江蘇省人民醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)心血管內(nèi)科賈恩志教授為該論文的通訊作者，鹽城市中醫(yī)院宋曉龍博士，江蘇省人民醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)心血管內(nèi)科博士研究生符亞紅、碩士研究生李城城為該論文的共同第一作者。

原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167488923001660?via%3Dihub